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【细节决定成败】让一例丑陋不堪的组织切片H&E染色变美的探索历程

Healsan Hanson临床科研 2020-02-27

组织切片是患者组织研究和动物实验最基本的技术手段,但切出可以进一步实验的组织并不是轻松的事情,里面有很多细节。


作者:

王孝养 博士

组织病理、细胞和动物模型群友



遇到问题


常规的组织切片通常是将石碏组织块放在冰水上浸泡十几分钟,然后再用Microtome进行切片,切片的厚度通常是4至5微米。下图是一例乳腺癌的组织,从这张图看得出来:片子细胞凹凸不平,尤其是细胞核成条状排练。这样的片子不论是用于临床诊断,还是科研用,肯定是拿不出手的。由于组织处理和石碏包埋不是我们做的,其操作详情不得而知。

  

有据假设,小心验证


我们推测是否是刀片变钝了,于是我们使出第一招

将切片机的一次性刀片换成了全新的,在切片的时候尽量均匀而又快速,希望能切出平平展展的组织。

  我们在热水摊片仪里摊片的时候也尽量摊的时间长一些,希望让片上的皱褶展平,但最后的结果还是不尽如人意,凹凸不平的情况并没有明显的改善。

        


我们推测可能组织太硬,所以需要软化一下,于是我们使出了第二招

让组织块在冰水中泡长一些时间,我们泡了一个小时以后再切片。

遗憾的是,这一招也不灵。

  


最后,我们使出了第三招,还是希望石蜡组织能够软化,这样切起来就不会太脆。

我们的方法是,将石蜡块放在37到38摄氏度的温水中,浸泡半个小时,然后再转到冰水中放置个1到2分钟后,立即切片,结果片子切得非常漂亮,成功了!

  

看看这张片子,以前的细胞核象3D丝粒体状的结构是否是消失了?

  胞浆和胞核的形态结构恢复了本来的应有的面目。

   

知所以然


做学问喜欢问个究竟,为什么开始的组织切片会成这样呢?原因不外乎两个:

第一,组织处理脱水不干净,

第二组织处理脱水过度,脱得太干了。


如果是第一种情况,石碏块泡在水中会发胀发白,这块组织没有这种现象。所以我们的结论是:这个组织标本的脱水过度了——太干了。


解决方案:

在组织处理时,组织在100%纯酒精里标本停留时间不能过长,根据组织大小,一般两到三个小时即可,如果是小标本可以更短一些。另外一个办法就是在纯酒精里面混合甲醇和异丙醇,这样就不会脱水太干。一旦出现脱水过度,先用温水浸泡半小时到一小时,再用冰水泡几分钟,即可切出漂亮的组织切片。


希望我的经验对感兴趣的同行有用。


群友讨论


群友 A:

这种overprocess情况,我一般是用三盆水解决:漂片水浴四十二三度放置十至十五秒,室温水三十秒,冰水三十秒即可切出三五张好片子。

如果切出来的组织部分基本透明说明水化充分,如果发白就需要再如上处理一轮。根据组织类型不同可以适当调节时间。


群友B:

组织太干也经常发生!现在都用机器自动处理,很多实验室不同组织就用一个protocol,导致不同组织脱水程度不同。

曾经切过骨骼肌组织,完全切不出片子,切到组织处就粉碎了,怎么切都不行一气之下扔那不管了,在冰水里泡了一天,再看时组织都鼓出来了,结果倒是切出好片子了,意外收获。


群友C:

在组织病理中心实验室通常不会按组织大小分开process。所以组织处理程序设计要以较大组织为标准设计时间和温度。

稍小的经过这种处理后肯定是over process。还好可以用“冰火两重天”这招来补救。

用冰水处理这一步我习惯把它叫rehydrate。这一步的关键是根据经验,不同的组织用不同的时间。千万不要over rehydrate,后果就是组织胀大,突出表面,切片后,过几天组织干了以后又收缩,表面出一坑,为将来重复切片带来困难。

还有就是包埋机冷台温度过低,冷却太快导致的组织与石蜡冷却凝固不同步。有时也可以表现为凝固的蜡快有裂隙。

冷台温度过低如果没办法调温的话,可以在冷台上加一层tissue paper再放包埋的molds,延迟一下会好很多。

我training技术员石蜡包埋技术时最长和他们说的就是石蜡;是技术员如何操控石蜡和组织温度,做到可控条件下让组织和石蜡凝固合为一体。

如果有很多都没处理好的话,最好倒回去重新用比较长的程序再处理一次。如果仅仅是浸蜡不够的话可以用融掉后,用真空烘箱再浸蜡一到两个小时即可。这种真空烘箱也适用于气孔较多的组织,可以保证让组织里的气泡全都消除,被石蜡取代。


群友D:

细节决定成败。



作者:王孝养 博士;本期编辑:Daniel。

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